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課堂 | Leica SP8 FALCON 使用技巧

2019-09-03 16:24:22 563
奧林巴斯顯微鏡


奧林巴斯顯微鏡

近期,我們介紹了 Leica SP8 FALCON 的一些應用案例,它能實時測量分子間的相互作用 (FLIM-FRET),實時測量鈣濃度變化,實時測量熒光分子的代謝 (如癌變引起的 NADH 的壽命變化) 或者所處微環境的變化 (如 pH),能對光譜相近的不同染料或自發熒光和染料進行拆分,還能與共聚焦的多種采圖模式 (如智能化大圖拼接、光譜掃描、時間序列、三維層切) 和技術 (如 DIVE 多光子成像、STED 納米分辨率成像) 相結合??傊?, FALCON 是熒光功能成像的極佳工具。


那么今天咱們就講講 FALCON 的使用技巧,幫助大家更好地理解這個新技術。


熒光壽命測量步驟

SP8 FALCON 的熒光壽命成像 (FLIM) 功能內置在共聚焦操作軟件 LAS X 里,只需點擊 FLIM 即可激活 (見下圖)。

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接下來,我們只需三步就可以完成熒光壽命測量。本文中所用樣品為雛菊 (Bellis Perennis) 花蕾。

1. 預覽及調節參數


點擊預覽,系統同時顯示熒光強度圖、平均熒光壽命圖和平均熒光壽命曲線,并以光子數直方圖中的紅線來提示光子數的理想上限 (見下圖),便于我們調節激光強度獲得理想的光子數 (以接近但不*過紅線為宜)。

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2. 設置條件并采圖


在采集時間、采集幀數及*大光子數三者中選擇設置一項即可 (見下圖),如果需要采集時間序列或者三維,按常規共聚焦采集模式設置總時長或層切起點/終點即可。然后點擊 start 進行采圖。

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3. 數據分析


選擇壽命成分數量 (見下圖一棕色箭頭),點擊 Fit (圖一紅色箭頭),系統即自動進行曲線擬合。壽命成分數量可從 1 開始,直至獲得滿意的擬合曲線 (見圖三)。同時,系統根據擬合結果顯示熒光壽命圖 (見圖二)。

奧林巴斯顯微鏡

圖一

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圖二

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圖三

到這里,圖像和數據的采集及分析就完成了,點擊保存圖像和結果即可。


一鍵采圖,一鍵擬合,so easy!


壽命成分拆分圖像

當然,我們還可以根據擬合出的壽命成分對圖像進行拆分,以上述分析結果為例,點擊 FLIM Image Fit,系統自動按照擬合出的三種壽命進行拆分,得到以下圖像。這特別適合于拆分光譜接近的不同染料或者染料和自發熒光。以后遇到多色熒光成像,再也不用擔心串色和分不開了。

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對厚樣品,FALCON 還可以直接采集和顯示三維的熒光壽命圖像 (見下圖),要做成視頻也完全沒有問題,用 LAS X 的 3D 重建模塊就可以。



SP8 FALCON 的功能還遠不止于此,它還能進行任意感興趣區域分析、FRET 分析、Pattern Match 分析,和 DIVE、STED 結合成像,以及近期剛剛增加的 Phasor 功能,為傳統的熒光成像增加維度、拓寬思路。有興趣的話,且聽下回分解。

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