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顯微鏡下的切割藝術:快速分離活細胞

2019-09-03 16:21:25 391
奧林巴斯顯微鏡


上世紀 90 年代,美國國家癌癥研究所(NCI)的 Lance Liotta 和同事在《Science》上發表文章,提出了一種稱為激光顯微切割(LMD)的技術。簡單來說,LMD 就是在激光脈沖形成的能量差作用下,目標(組織、單細胞甚至亞細胞結構)邊緣被切斷分離,特異性地收集感興趣區域,從而在下游實驗(如二代測序、PCR 和蛋白質組學)中獲得更加有效和準確的結果。

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▲ Lance Liotta博士及其同事在《Science》上發表的文章


顯微切割的材料可以是以各種方式貼附于固相支持物上的各種組織、細胞甚至生物大分子,其來源十分廣泛,石蠟組織切片、冰凍組織切片、細胞爬片以及活細胞均可采用,之前對于組織切片的切割應用已有所描述,今天我們一起來看看徠卡 LMD 在活細胞提取上的應用實例。


在生物醫學研究中,我們經常需要從混合群體中選擇和分離具有相同特征的單個活細胞或活細胞亞群來獲得細胞系或同種細胞群。常用的方法中,如熒光激活細胞分選法、磁活化細胞分選法、有限稀釋法等技術只能夠對非貼壁細胞進行選擇性分離,上述方法都存在一個比較大的弊端——需要用到機械力或生物酶使細胞團分離,這對細胞的形態和活性會產生較大影響。與上述技術不同,徠卡LMD 使用紫外激光把目標切割下來,依靠重力作用自由掉落到收集裝置內,有效避免了接觸污染和外力損傷,保證了細胞的生物活性。


下面,讓我們一起去看看 Podgorny 博士利用顯微切割收集活細胞并再培養的整個流程。



材料方法

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將 HeLa 細胞懸液 2 ml(4 × 105 cells/ml)接種于顯微切割專用的細胞培養皿內(直徑 50 mm),這種培養皿的底部是聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)薄膜,可以先用多聚賴氨酸對培養皿內部的 PEN 膜進行處理來提高細胞的貼壁能力。為避免底部 PEN 膜污染,將專用培養皿放入直徑 90 mm 的塑料培養皿中,培養一天,等到細胞貼壁后進行顯微切割。


 

▲ 視頻 1. LMD切割、提取多細胞


實驗結果

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為了檢查切割直徑對細胞克隆形成率的影響,作者以 50~600 μm 的直徑進行切割,獲取的細胞再進行兩天的培養,然后檢查了克隆形成率。

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▲ 圖 1. 不同切割直徑下的細胞克隆團 (標尺 100 μm)


經過培養后作者發現,切割直徑在 100 μm 以上的細胞經過 2 天培養后,均可形成細胞克隆團(圖 1)。


那么激光在切割的過程中對細胞會造成多大的損傷呢?帶著這個疑問,作者進行了接下來的實驗。


首先,在顯微切割之前,給細胞標記了碘化丙啶(PI),PI 能夠插入雙鏈 DNA 中,它被活細胞排斥但能穿透正在死亡或已經死亡的細胞的細胞膜。這樣一來,在熒光模式下就能區別出哪些是功能正常的活細胞,哪些是死細胞。作者選取了全部是活細胞的區域。

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▲ 圖 2. 標記  PI 的  Hela 細胞(標尺 200 μm)


箭頭所指的區域為熒光模式下顯色的死細胞,作者將這些區域排除在外,進行了切割(圖 2)。然后立即對收集到的樣品進行了 SYBR Green 和 PI 雙色標記,與切割之前的樣品進行對比,從而判斷激光對細胞的損傷程度有多大。

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▲ 圖 3. 標記  PI 和 SG 的  Hela 細胞(標尺 100 μm)


在熒光模式下可以觀察到,紫外激光束只會對*邊緣處的細胞造成損傷,對內部的細胞不會造成影響(圖 3) ,根據作者的統計,細胞的存活率可以達到 83% 以上。


為了進一步觀察經過激光切割后的細胞活力,作者以 200 μm 的直徑獲取了單個細胞,進行了長達 7 天的培養。

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▲ 圖 4. 單細胞克隆團形成過程(標尺 100 μm)


結果表明,在經過 7 天的培養,由單個細胞形成了單細胞克隆團 (圖 4) ,這對于從混合群體中選擇和分離具有相同特征的單個活細胞或活細胞亞群,以獲得細胞系或同種細胞群具有十分重要的意義。


 

▲ 視頻 2. LMD 快速提取單細胞


Leica LMD6 /LMD7 激光顯微切割基于全自動研究級正置顯微成像,借助重力收集樣品,非接觸式不會對切割樣品造成污染。專利的激光束運動模式可以在樣品靜止的同時實時快速、精確、可靠的切割。

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此外,徠卡使用全套LMD專用物鏡,對于UV光具有高透光率,20x, 40x和63x物鏡均為長工作距離物鏡,可以很好地兼容活細胞切割實驗。

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活細胞的切割獲取今天就先講到這里了,多激光顯微切割應用方向和使用技巧請參考往期介紹或直接聯系我們索取 1000 多篇顯微切割各研究方向文獻。


更多活細胞切割應用請參考:

Isolation of living apical and basal cell lineages of early proembryos for transcriptome analysis

Zhou X, Shi C, Zhao P, Sun M
Plant Reprod. 2018 Dec 13. doi: 10.1007/s00497-018-00353-6.


Long-distance electron transport in individual, living cable bacteria
Bjerg JT, Boschker HTS, Larsen S, Berry D, Schmid M, Millo D, Tataru P, Meysman FJR, Wagner M, Nielsen LP, Schramm A
Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 May 7. pii: 201800367. doi: 10.1073/pnas.1800367115.


A novel ex vivo Huntington's disease model for studying GABAergic neurons and cell grafts by laser microdissection
André EM, Daviaud N, Sindji L, Cayon J, Perrot R, Montero-Menei CN
PLoS One. 2018 Mar 5;13(3):e0193409. doi: 10.1371/journal.pone.0193409. eCollection 2018.


miR-182 Regulates Slit2-Mediated Axon Guidance by Modulatingthe Local Translation of a Specific mRNA

Cell Rep. 2017 Jan 31;18(5):1171-1186. doi: 10.1016/j.celrep.2016.12.093.



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