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哪種傳感器適合共聚焦成像?

2020-05-27 13:35:31 Pooher Inc. 116

哪種傳感器*適合共聚焦成像?

混合光電探測器(HyD)是!在這篇簡短的文章中解釋了為什么會出現這種情況。

生物學研究關注生命,因此,如果可能的話,應該用顯微鏡研究活體樣品。熒光染色應盡可能稀疏,以盡量減少對生物功能和參數的任何潛在的操作影響。背景應該是漆黑(給定干凈的樣品)并且信號沒有不必要的噪聲。因此,共焦熒光成像需要高靈敏度和光子效率的設備。除了光學鏡頭和濾光片外,傳感器在實現這一目標方面發揮著重要作用。迄今為止取得了良好的效果,其中有一些苔蘚過度生長的真空技術,由PMT(光電倍增管)代表,以及更多現代半導體技術,以APD(雪崩光電二極管)為代表。

混合探測器(HyD)是這兩種技術的嵌合體。它靈巧地結合了這兩個概念,并保持了兩者的有益特征:

l短脈沖和相等的脈沖

l噪音極低,而且

l動態范圍大。

傳感器類型

真正的共聚焦掃描顯微鏡將光線聚焦成一個點。為了生成二維圖像,必須在樣品上沿x和y方向掃描該斑點。盡管掃描機器在設計和制造方面需要一些努力,但是與寬視場相機芯片相比,傳感器可以是單個設備,其必須提供與所請求的圖像元素(像素)并行的盡可能多的傳感器元件。由于不需要xy讀出電子器件,與陣列檢測器相比,單點傳感器具有更好的信噪比。

光電倍增管(PMT)

到目前為止,*著名的共焦成像傳感器可能是經典的PMT(圖01),它在80年前的1930年代早期開始其職業生涯[ 1 ]。它基于光電效應,首先由H.赫茲[ 2 ] 描述并由A.愛因斯坦[ 3 ] 解釋。光電子陰極,通常是在吸收光子時可以容易地釋放電子的堿性原子層,暴露于輻射源(這里,光聚焦在光電陰極上)。使用砷化鎵磷化物陰極(GaAsP)在可見光范圍內實現量子效率方面的*佳性能)。電壓將光電子加速到第一打拿極,其中二次電子被釋放。由于倍增極材料的特性,倍增電極的增益通常限制在小于五倍。由單個打拿極產生的電脈沖不能與電噪聲區分開。為了獲得足夠的增益,二次電子被加速到下一個打拿極等等[ 4 ]。該程序允許增益大約為10 8甚至更多,這足以獲得可測量的電流。

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01:光電倍增管(PMT):光子(hν)撞擊光電陰極,其中釋放光電子(e-)。電極數(藍點)在每個打拿極處倍增,*后的電子云在陽極讀出。

光電倍增管具有非常寬的動態范圍,即它們可用于非常低的光子密度和相對較高的強度。

雪崩光電二極管(APD)

真空PMT的半導體對應物通過發明APD而被推向市場,APD是PIN二極管的衍生物。PIN二極管在p型和n型層之間具有額外的稀疏摻雜層。該APD是一個改進的PIN二極管,輔以倍增層(圖02)。如果光子在本征層中被吸收,它將產生電荷對(內部光電效應),然后通過施加的電壓加速電荷。倍增區中的強電場(圖02中的pn)通過釋放許多(*多約1000個)附加電荷而引起放大。輸出信號與吸收的光子數成比例,因此,該器件可以在一定強度范圍內用作光傳感器。在較高的電壓下,光子的吸收會導致擊穿并伴有非常高的增益(高達10 8,“蓋革模式”),通常用于單光子探測。由于連續擊穿會破壞器件,因此該模式僅適用于足夠低的光強度。

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02:雪崩光電二極管(APD):固有(i)區域中光子的吸收導致電荷分離。電荷加速到乘法區(pn),在那里實現增益。

APD已成功用于單光子測量,特別是在FLIM(熒光壽命成像)和 FCS (熒光相關光譜)實驗中。但是,它們很少用于共焦圖像記錄。

混合探測器(HyD,HPD)

PMT的主要限制是每個乘法步驟的低增益。的APD的主要限制是其范圍的操作:只有非常低的強度(在蓋革模式)。這兩種技術的混合組合提供了一種解決方案,幸運的是它顯示了兩者的有益特征。這種真空和半導體技術的結合*初是為粒子物理實驗而開發的[ 5 ]。

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03:混合檢測器(HyD):光電子吸收光子(hν)釋放光電子(e-)。光電子通過高電壓加速并在碰撞到半導體靶中之后耗散其能量。通過倍增區(pn)再次放大電荷數,并且可以在陽極讀出信號。

混合探測器使用光電陰極(如PMT)和GaAsP以獲得*佳性能。光電子通過大約8000伏的高電壓一步加速。高能光電子撞擊半導體靶,其中動能被消散,并被轉換成分離的電荷(電子 - 空穴對)。此步驟中的增益已經大約為1500.下面的乘法層(參見雪崩二極管)再次將信號提升約100倍?,F在,在陽極處拾取可測量的信號就足夠了。該信號是一系列電脈沖,其中每個脈沖與到達陰極的一個光子相關。

參數

盡管三類傳感器都將光子轉換為電信號,但它們的表現卻截然不同。為了找出*適合共聚焦成像的傳感器,我們將簡要介紹三個重要參數:

l噪聲,

l脈沖均勻性,和

l脈沖寬度。

如果我們想要使用光子計數而不是模擬積分,后兩者是非常重要的6 ]。光子計數更精確,并提供像素信息與樣本亮度的直接比率。

噪聲

在各種噪聲源中,暗噪聲嚴重影響低強度圖像的質量。在我們的上下文中的暗噪聲表示陽極處的信號(電脈沖),而沒有光子被陰極吸收。它基本上由敏感元件的溫度及其尺寸決定。例如,如果溫度足夠高以引起偶爾從陰極材料釋放電子,則光電陰極本身將在絕對黑暗中發射電子。通過施加的電壓加速該電子并在陽極處產生看起來像光子脈沖的脈沖。此外,倍增電極可以發射熱電子,其中第一倍增電極產生比更靠近陽極的倍增電極更高的脈沖。由此我們可以得出結論,來自打拿極的熱電子只是與PMT有關的問題:APD沒有打拿極。光電陰極和倍增電極的熱電子發生的對應物是半導體材料的熱電荷分離。整體暗噪聲由來自所有可能貢獻者的電子組成。如果需要非常低的暗噪聲,傳感器將受益于冷卻:在將溫度降低大約5 K時,暗噪聲減半(取決于材料)。極低強度的應用甚至使用液氮冷卻來基本上消除暗噪聲。

陰極尺寸約為50 mm 2的經典PMT 加上額外的打拿極區域,具有相當高的暗噪聲(見表01),這可防止它們用于光子密度非常低的應用中。對于實時樣品實驗,目標是盡可能使用昏暗的照明光,以免通過光毒性反應破壞樣品。不幸的是,這個要求會增加噪音問題。APD和HyDs沒有打拿極。對于這些設備,暗噪聲主要由傳感器的有效區域控制。APD的有效面積通常約為0.05 mm 2,即非常小,需要額外的手段和努力來將光穩定地聚焦到目標上。請記?。汗步癸@微鏡不使用固定的掃描光束,而是使用掃描光束。除此之外,光學部件的多種選擇以及對精確對準的需求也會增加。HyD的有效面積約為7 mm 2,小到足以抑制暗噪聲[ 7 ] 并且足夠大以確保即使在緊張的條件下也能完全拾取光信號。

脈沖高度分布

理想地,從陰極釋放的任何光電子的輸出脈沖看起來完全相同。雖然實際上,這個假設遠非實際,特別是對于PMT,我們將在下面看到。脈沖寬度和光子吸收與輸出脈沖峰值之間的時間(稱為“傳播時間”)不僅變化,而且脈沖的高度也變化。脈沖高度變化直接導致通過積分陽極電流記錄的信號的變化(噪聲)。在光子計數的情況下,如果不能將脈沖與放大電路的電子噪聲區分開來,脈沖高度的變化可能導致計數損失(參見表01和圖4,PMT情況下的事件#2等同于事件#3)在HyD案件中#4。

輸出脈沖的高度基本上由第一個放大步驟8 ] 的增益決定。對于PMT,這是第一個打拿極的增益。如上所述,該增益受到倍增極電極材料的限制并且落在2到8的范圍內。該變化由泊松統計量控制,例如,如果我們假設平均增益為4,則變化為+/- 2,這意味著在下一次事件中很有可能獲得2到6個電子。然后脈沖高度變化大約三倍。后期倍增電極的增益具有相同的統計行為,但隨著電子數量從打拿極增加到打拿極,這些變化被平均并且對噪聲貢獻較小。

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04:PMT信號和HyD信號(PMT虛線和HyD實線)的比較。由于峰值變化,HyD的計數#2在PMT情況下丟失。HyD的計數#3和#4由于寬的脈沖寬度而“熔化”在一起成為PMT的單個計數。

HyD中情況完全不同,其中第一步的增益為1500.增益的變化與其平方根(Poisson統計)成正比,因此,峰值變化變化小于3%,即100倍優于PMT案例。由于脈沖高度均勻,特別是使用HyD的光子計數更加精確。如前所述,光子計數是強度測量的金標準。

脈沖寬度

通過計算傳感器輸出端的脈沖來完成光子計數。更亮的強度與每次更多的脈沖相關。如果強度*過一定水平,則脈沖開始“融合”在一起并且各個事件不能分開(參見圖04和表01)。該光強度水平顯然與電脈沖的寬度強烈相關:脈沖越細,可用于成像的強度越高。通常用于共焦成像的PMT產生相當長的脈沖,在大約20ns的范圍內。光強度是在給定像素中檢測到的每單位時間的光子量。在光子計數模式中,強度被描述為“每秒計數”。如果光子以相同的間隔到達20 ns,一秒鐘將持有5000萬計數(每秒50兆位--50麥克風)。但光子以隨機方式從樣品中發射,因此*大允許脈沖僅為約15 Mcps。標準熒光樣品在共聚焦體積中可提供約100 Mcps,因此在光子計數模式下使用PMT無法測量其信號。APD的動態范圍受限,因為傳感器在每次脈沖后需要很長的死區時間進行再生。在脈沖持續時間和死區時間內到達的光子會丟失。只有極低的強度才能用APD準確量化。因此,在光子計數模式下,PMT無法測量其信號。APD的動態范圍受限,因為傳感器在每次脈沖后需要很長的死區時間進行再生。在脈沖持續時間和死區時間內到達的光子會丟失。只有極低的強度才能用APD準確量化。因此,在光子計數模式下,PMT無法測量其信號。APD的動態范圍受限,因為傳感器在每次脈沖后需要很長的死區時間進行再生。在脈沖持續時間和死區時間內到達的光子會丟失。只有極低的強度才能用APD準確量化。

HyD顯示大約1 ns的脈沖。帶有HyD的SP8平臺可以高達300 Mcps的速度運行,因此適用于標準熒光共聚焦成像。其動態范圍涵蓋非常低的光強度和用于共聚焦成像的標準熒光染色樣品。

概要

與光電倍增管(PMT)相比,混合檢測器(HyD)顯示出非常低的噪聲,如標簽01的第一行所示。暗噪聲電平與雪崩光電二極管(APD)相當。此外,脈沖非常均勻,這使它們成為光子計數的理想設備 - 類似于APD,如標簽01的第二行所示.PMT和APD之間的區別是非常短的脈沖寬度,沒有延遲時間(第三行)標簽01)。這種差異允許HyDs用于檢測通常在熒光樣品中發現的強度,而APD在飽和后會很長。HyD產生清晰的熒光圖像,具有真正的黑色背景,適用于低強度情況(如高速實時成像)和標準熒光樣品。

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標簽01:概述PMT,APD和HyD的*重要參數(用于共焦成像的單位的典型值 - 給定傳感器的實際值可能顯著不同)。

HyD配備有砷化鎵 - 磷化物(GaAsP)陰極。HyD量子效率與GaAsP PMT 相同。盡管如此,由于光電子的短而直的軌跡,HyD光子探測效率甚至優于PMT。

順便說一句,HyDs也是特殊應用的理想傳感器,如熒光壽命成像(FLIM)和熒光相關光譜(FCS),因為它們顯示非常窄的傳輸時間變化,并且基本上沒有脈沖后。這使得HyD成為任何基于光束掃描的顯微鏡傳感器的冠軍。


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