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奧林巴斯顯微鏡熒光濾光片

2019-09-02 16:01:56 Pooher Inc. 541

應用于熒光濾光片的術語由于不同制造商使用各種縮寫來識別濾光片而變得混亂。在這個討論中,我們試圖對這個混淆的術語做出一些排序?;旧嫌腥N類型的濾光片可供選擇:激勵濾光片,屏障濾光片和二色分光鏡(二向色鏡),通常將這些濾光片組合起來以產生類似于圖1所示濾光片的濾光片。正確選擇濾光片是成功的熒光顯微鏡。

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激發濾光片僅允許來自照明器的選定波長在通向樣品的路上通過。屏障濾波器是設計用于抑制或阻擋(吸收)激發波長并僅允許選擇的發射波長通過眼睛或其他檢測器的濾波器。二色分光鏡(二向色鏡)是專門設計用于有效反射激發波長并傳輸發射波長的濾光片。它們用于反射光熒光照明器,并位于激勵濾波器之后但屏障濾波器之前的光路中。如圖1所示,雙色分光鏡與通過激發濾光片的光線成45度角,并與屏障濾光片呈45度角。

熒光濾光片以前幾乎完全由夾在玻璃之間的彩色玻璃或彩色明膠制成。由于采用了更為復雜的濾波技術,已經開發了干涉濾波器,其由玻璃上的介電涂層(具有變化的折射率和反射率)組成。這些濾光片設計用于以高選擇性和高透射率傳遞或抑制光的波長。今天的大多數激勵濾波器都是干擾類型; 為了特殊需要,一些屏障過濾器也是干涉類型。雙色分光鏡是專用的干涉濾光片。有時將短通濾波器(SP)和長通(LP)濾波器組合起來以縮小通過這種組合的波長帶。(圖3(c))

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勵磁濾波器 - 制造商用來表示其濾波器性能的縮寫包括:UG(紫外線玻璃)和BG(藍色玻璃),它們是玻璃激勵濾波器。 KPK是kurz的縮寫,德文簡稱),SP是短通濾波器; 和 EX指示的激勵器過濾器。

今天,大多數勵磁濾波器都是干擾類型的。如圖2(a)所示,KPSP濾波器的透射曲線在曲線的右側顯示陡峭的下降。如果勵磁濾波器標有字母BBP,則它是帶通濾波器(圖3)。甲BP濾波器是具有波長截止兩者的左側和其曲線的右側的過濾器(參照圖3(a)和3(b))。與這些濾波器相關的數字可能是指帶通激勵濾波器的*大傳輸波長。對于SPKP濾波器,該數字可以指*大傳輸的50%處的波長。對于帶通濾波器,有時會說明在50%的*大傳輸水平下的納米帶寬。帶通濾波器被設計為僅通過波長譜的期望波段; 許多干涉帶通濾波器通過一個窄譜帶。一些制造商標記其干涉濾波器的名稱為IF。如果斯托克斯位移很小,窄帶干涉帶通濾波器特別有用。

屏障過濾器 - 屏障過濾器的縮略語或縮寫包括:LPL用于長通濾光片,YGG用于黃色或gelb(德國)玻璃,RRG用于紅色玻璃,OGO用于橙色玻璃,K用于kante,a德語術語邊緣(濾波器),BA 為屏障濾波器。

阻擋濾光片阻擋(抑制)較短的波長,并且對于較長的波長具有高透射率。當濾波器類型也與數字相關時,例如BA475,該指定是指在其*大傳輸的50%時的波長(納米)。屏障濾波器的曲線通常在左側顯示出尖銳的邊緣,表示波長位于該邊緣的左側(參見圖2(b))?,F代屏障濾波器通常是干擾類型,其中許多是透射曲線左側和右側帶通銳截的帶通,如下圖3所示。

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二色性分束器 -使用的縮寫來描述和識別的分束器是:CBS用于色分束器,DM為二向色鏡,TK為“teiler坎特”,德國用于邊緣分離器, FT 為“FARB teiler”,德國的彩色分離器,和RKP反射短傳。所有這些術語都應該被認為是可以互換的。

這些濾波器始終是干擾類型。這些涂層被設計成對較短波長具有高反射率,對較長波長具有高透射率。二色分光鏡的方向與通過反射光熒光照明器進入立方體的激發光路徑成45度角。它們的功能是將選定的激發(較短波長)光通過物鏡并照射到樣品上。它們還具有將更長波長的光傳遞到屏障過濾器的附加功能,并將任何散射的激發光反射回燈箱的方向。

在許多當前的反射光熒光照明器中,激勵濾波器,分色鏡和屏障濾波器都被合并到如圖1和6所示的單個立方體中。照明器借助滑動器或旋轉裝置可以包含多達三個或四個立方體,從而使用戶可以方便地使用各種規格的熒光染料。為了優化某些熒光染料的激發或發射波長,可以容易地附加替代激發器和屏障。標準的激勵濾波器和屏障濾波器是用戶可拆卸的,因此定制的濾波器也可以安裝到顯微鏡中。

通常,燈罩內裝有紅外線或熱過濾器,以防止熒光過濾器受熱劣化。某些照明器可能會加入或接受紅色抑制濾鏡(指定為BG38),以消除與某些濾鏡組合相關的視場背景變紅。而且,照明器可以接受中性密度濾光器和/或具有不透明的光快門以減少或暫時阻擋光到達樣品。

建議您咨詢制造商,了解他們在命名和識別其特定過濾器時使用的程序。我們的數據表中給出了Olympus熒光顯微鏡命名使用的樣品,但您應該記住,制造商的命名規則有所不同。顯微鏡公司可以為其激發器和屏障濾光片以及它們的分色鏡提供透射曲線。截至1998年7月,這些信息并未在主要制造商的網站上提供,但我們將在鏈接可用時提供。

藍色激勵的立方體 - 為了理解立方體的功能,讓我們以藍色激勵的常用立方體為例。這個立方體(使用奧林巴斯U-URA照明器名稱)是U-MWB立方體。該U形MWB立方體具有一個帶通450-480激勵器過濾器,如在圖4(a)所示。該名稱意味著高比例的激發光波長在450和480納米之間。這個立方體中的分色鏡是DM500,如此命名,因為500納米是該鏡面*大透射率的50%處的波長。該鏡面的透射曲線顯示500納米以上的高透射率,500納米左側的透射率急劇下降,500納米左側的*大反射率,但仍可能在500納米以下具有一些透射率。該立方體中的屏障濾波器是BA515,它具有515納米以下的陡峭斜率,因此在515以下通過的光線很少。BA515是一種長通濾波器,可以將高于515的高波長從綠色傳輸到遠紅(圖4(a))。

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如果您希望縮小藍色激發的激發頻帶,可以選擇U-MWIB立方體。該立方體具有干涉激發濾波器(在激勵帶兩側非常尖銳的斜率)BP460,二向色鏡DM505和屏障長通515IF(干涉屏障濾波器)。如圖4(b)所示,激發器和屏障濾波器的尖銳斜率在激發和發射波長分離方面做得更好,并具有*小的重疊。

如果您希望進行藍色激發,但希望將發射的波長限制穿過屏障濾光片,僅限于綠色發射,則可以選擇U-MWIBBP立方體。該立方體與U-MWIB立方體具有相同的激發器和分色鏡,但作為其屏障濾波器,它具有帶通BA515-550(不是長通濾波器)。這種屏障濾光片僅通過515-550nm之間的綠色波長的光,并阻擋550以上的更長波長,并阻擋短于515nm的波長(圖5(a))。

還有其他用于藍色激發的立方體,例如在我們的熒光立方體數據表中與其他U-URA立方體一起列出的U-MNIBU-MNIBBP立方體。如果沒有一個顯微鏡制造商的立方體符合您的需求,您將不得不去外部商業制造商用于定制過濾器和分色鏡。大多數顯微鏡制造商現在生產具有可拆卸激勵器和屏障過濾器和可拆卸二向色鏡的立方體。立方體的功能是使用激發濾光器來使激發光達到熒光色素; 以確保分色鏡對期望的激發光的*大反射; 并*終采用屏障濾波器來傳遞期望的發射波長,但阻擋不想要的激發光或特定的不想要的發射波長。

IGS Cube - 除標準熒光立方體外,制造商還可提供用于免疫金染色的立方體。該立方體代替分色鏡,具有與用于冶金明場反射光顯微鏡的類似的標準半透鏡。取代激勵濾波器,定位了長通420納米屏障濾波器(以阻擋420以下的光線)和偏振濾波器,使偏振濾波器僅通過垂直于進入立方體的光線向東西方向振動的光線。取代立方體上的屏障濾波器,還有另一個偏振濾波器(用作分析儀),它只允許南北向光路振動的光線通過眼睛或探測器。分析儀可能被放置在相對于偏振器不太正確的交叉位置。

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多染色 - 研究人員在進行多種熒光染色時經常遇到交叉問題。例如,在使用異硫氰酸熒光素(FITC)和羅丹明共軛物的常見雙重染色中,可能是激發FITC(綠色發射)的藍色激發光也會引起羅丹明共軛物的激發(紅色發射)。對于這種污漬組合,您可以嘗試U-MWIBBP立方體(請參閱奧林巴斯U-URA立方體濾光片規格的數據表)。這個立方體有一個460-490納米的帶通激勵濾波器,它將激發FITC。該特定立方體的屏障濾光片不是長通濾光片,而是515-550nm的帶通,它將限制發射,到達眼睛或其他檢測器,達到綠色波長,并阻止羅丹明的紅光發射。

第二個立方體U-MNG具有用于羅丹明軛合物的綠色激發的帶通激發濾波器530-550。U-MNG立方體的屏障過濾器是長通BA590,它允許若丹明的紅色發射到達眼睛或其他檢測器(例如電影或視頻)并阻止任何綠色發射。

通過交替地將U-MWIBBP立方體和U-MNG立方體旋轉到光路中,您應該能夠在雙染色樣品中分離綠色發射的FITC和羅丹明的紅色發射。(圖5)同樣,對于多種熒光染料的其他組合,用戶必須知道熒光染料的激發 - 發射光譜和顯微鏡制造商提供的立方體的透射曲線。

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來自不同制造商的熒光立方體外殼通常是不可互換的,并限制在制造商提供的特定照明器內使用。圖6所示的立方體顯示了目前奧林巴斯提供的幾種設計。應該牢記的是,一個制造商的立方體的單個元件(激發濾光片,屏障濾光片和二向色鏡)有時可以調整以適合另一個制造商的立方體。這個任務留給個人用戶通過反復試驗來確定。

在某些情況下,可能需要尋找定制的濾光片(參見數據表中的光源)以確保所需的激發波長和/或熒光發射波長的分離?,F在幾個商業來源還提供定制過濾器和分色鏡,安裝在一個由制造商提供的單個立方體中,能夠處理雙熒光染色或三重熒光染色標本,而不存在交叉問題(例如DAPI和FITC,DAPI和FITC &TEXAS RED,pararosaniline&acriflavin等)

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圖7中顯示的顯微照片給出了在單個立方體內使用多個熒光濾光片成像的雙染色標本的優秀實例。樣品用FITC(異硫氰酸熒光素)和羅丹明 - 鬼筆環肽染色以選擇性地突出微管和肌動蛋白絲。立方體是奧林巴斯WIBAWIG組合拍攝的計劃熒光40X物鏡和PM30自動顯微攝影系統。


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查看原始的英語文章:Brief Overview of Fluorescence Filters

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