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線蟲顯微成像--從宏觀到微觀

2018-04-08 10:57:04 484

線蟲是神經發育、細胞分化、細胞凋亡和衰老研究常用的模式動物。線蟲結構簡單,培養方便,繁殖迅速,對實驗條件的要求也低于哺乳動物組織和細胞。線蟲研究中,*重要的工具就是顯微鏡。從幼蟲的挑選、基因注射到功能成像,都會用到顯微鏡系統。

線蟲挑選:

因為線蟲成蟲長度大約1mm,直徑小于100um,放大到10-40倍范圍后,肉眼即可清晰分辨。這個放大范圍既可以用顯微鏡,也可以用體視鏡實現。通常研究人員對選擇使用體視鏡挑選線蟲成蟲,一方面放大倍數足夠,另一方面原因是體視鏡鏡體與基座距離較遠,操作的空間比較大,容易操作。

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線蟲挑選:顯微鏡型號OLYMPUS SZ61

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線蟲熒光篩選:顯微鏡型號OLYMPUS SZX16

顯微注射:

修改線蟲的基因非常容易,不管是穩轉或者瞬轉,都可以通過將基因組注射至蟲體末端生殖腺內即可。這個操作通常是在特殊的倒置顯微鏡上進行的,放大倍數通常在200-400倍。

這里的倒置顯微鏡與通常觀察哺乳動物細胞的顯微鏡不同,觀察細胞的顯微鏡只需要看到平面信息即可,但是線蟲顯微注射時,不僅需要看到平面信息,還需要看到立體信息,以方便定位注射點。這就需要顯微鏡配備霍夫曼成像或者DIC成像模式,*好是高分辨率DIC成像模式。高分辨率DIC成像模式,可以對厚組織的線蟲蟲體清晰成像,同時提供了三維立體的效果,方便注射操作。

另外還需要配套的顯微注射系統。不同于IVF等哺乳動物胚胎細胞的操作需要吸附和注射兩部分系統,因為線蟲蟲體經過固定,只需要一側的注射針即可。當注射操作量較大時,人們往往喜歡氣動甚至電動的注射系統,減少操作的工作量。

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線蟲顯微注射:顯微鏡型號OLYMPUS IX73

功能成像:

在進行線蟲的功能成像時,因為線蟲通常位于瓊脂載玻片上,蓋上蓋玻片后使用正置油浸物鏡可以使鏡頭更貼近蟲體,成像更加清晰。對于固定或者左旋咪唑麻醉的線蟲,可以使用普通正置顯微鏡或者正置共聚焦,實現高分辨率熒光成像,但是同樣由于線蟲蟲體厚度原因,需要搭配高分辨率DIC成像模式,以獲取明場圖片。

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線蟲功能成像:顯微鏡型號OLYMPUS BX53

但是對于活的甚至是運動的線蟲,尤其是運動神經研究等,不僅需要上述正置顯微鏡和高分辨率DIC模塊,更重要的是能否使視野隨著線蟲移動。這就需要電動載物臺和特殊的軟件相配合,根據線蟲熒光蛋白的位置變化,控制電動載物臺進行實時的追蹤。

總結各類解決方案:

蟲體挑選所用的體視鏡,可以選擇SZ61/51,配合10倍目鏡時,放大倍數在10-40倍。操作簡單,節省占地。

顯微注射所用的顯微鏡,可以選擇IX73,配合旋轉載物臺IX2-GS,方便定位蟲體生殖腺位置。需要配合RC模塊或者HR-DIC高分辨DIC成像模塊,可以實現高分辨率的線蟲立體成像。

功能成像時,如果是固定的線蟲,可以選擇BX53/63、IX73/83配合LED熒光光源和高靈敏黑白sCMOS相機,可以輕松實現線蟲的高分辨率熒光成像。如果需要明場成像時,也需要配合HR-DIC高分辨DIC成像模塊,對于線蟲這種厚組織樣本,成像效果*好。


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